Anwendungen - Präsentationen Autoren: Paul Held, Applications Department, BioTek Instruments, Winooski, VT Gavin Picket, Keck-UNM Genomics Ressource, Universität von New Mexico, Albuquerque, NM Dieses Plakat wurde am Internationalen Symposium über Laborautomatisierung und Robotik, 17, 2001 Die Herstellung von Mikroarrays erfordert das Aufspüren einer großen Anzahl von einzigartigen DNA-Fragmenten auf verschiedene Substrate. Während mehrere kommerziell verfügbare Instrumente diese Spotting-Aufgabe automatisiert haben, werden die Probenpräparation, die Kulturvermehrung und die Erhaltung der DNA-Bibliothek oft manuell mit Mehrkanalpipetten in Formaten mit 8 × 12, 96 Vertiefungen oder 16 × 24, 384 Vertiefungen durchgeführt. Manuelle Mehrkanalpipetten sind zwar effizienter als Einkanalpipetten, stellen aber noch ein großes Pipettierpotenzial mit vielen Möglichkeiten für Pipettierfehler dar. Hier beschreiben wir die Verwendung des automatischen Pipettiersystems Precision 2000 TM, um viele der erforderlichen Pipettieraufgaben für die Probenvorbereitung für die Mikroarray-Spotting durchzuführen. Diese Schritte umfassen die Vermehrung von Plasmidbibliotheken, die PCR-Reaktionsvorbereitung, die Behandlung von PCR-Produkten für die Agarosegelelektrophorese und die Rekonstitution von lyophilisierten Proben vor dem Microarray-Spotting. Die Precision 2000 verfügt über eine vollständig konfigurierbare Sechs-Stationen-Plattform, um die erforderlichen Pipettenspitzen, Reagenzrinnen und Mikroplatten (96- und 384-Well) für den Flüssigkeitstransfer zu halten. Die Plattform ist herausnehmbar und ermöglicht eine einfache Bedienung, einfache Reinigung und Einrichtung des Instruments. Der 8-kanalige Pipettenarm bewegt sich nach oben und unten sowie seitlich, während sich die Plattform von vorne nach hinten bewegt, um einen kompletten Zugang zu allen Stellen auf der Arbeitsplattform und vollständiger Konfigurierbarkeit zu ermöglichen. Der Pipettenarm nutzt eine proprietäre Technologie, um zuverlässig jede Standardspitze aufzuheben und zu versiegeln, mit einzelnen, frei schwimmenden Fässern, die Spitzen aus Position heraus kompensieren. Ein optionaler Schnellverteiler mit 8 Kanälen, der eine präzise, bidirektionale Spritzenpumpe einsetzt, um Flüssigkeiten aus einem großen, drucklosen Vorratsbehälter genau und schnell abzugeben, ist ebenfalls erhältlich. Der Precision 2000 verfügt über einen eingebauten Mikroprozessor, der alle Bewegungen steuert. Die flexible Software, sowohl Onboard als auch PC-basiert, bietet vollständige Programmiermöglichkeiten. Für eine vollständigere Automatisierung können Robotik-Schnittstellen mit ActiveXreg Software-Befehlen entwickelt werden. Der Precision 2000rsquos ist klein, mit einer Abmessung von 15 x 21 Zoll und einer Höhe von 16 Zoll. Er kann fast überall eingesetzt werden, einschließlich der meisten biologischen Sicherheitswerkbänke oder chemischen Dunstabzugshauben. BioTek Precision 2000 automatisiertes Mikroplatten-System MJ-Forschung Thermocycler Qiagen BioRobot 3000 BioRobotics Microarray-Spotter Savant-Lyophilisator BioTek PowerWave X-Mikroplatten-Spektrophotometer Materialien und Methoden Um die Precision 2000-Niedervolumen-Pipettierfähigkeiten zu bestimmen, wurden konzentrierte Farbstofflösungen mit dem Precision 2000 ausgegeben Wurden einige Experimente, blaue Farbstofflösung in TRIS-Pufferverdünnungsmittel, in saubere trockene Platten (entweder 96-well oder 384-well) abgegeben und farbloses TRIS-Pufferverdünnungsmittel zugegeben. Die resultierende Extinktion wurde dann bei 595 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Absorptionslesers abgelesen. In anderen Experimenten wurde gelber Farbstoff zu den Vertiefungen gegeben, die bereits das Verdünnungsmittel enthielten. In diesen Experimenten enthielten sowohl der Farbstoff als auch der farblose Puffer auch 0,1 Tween 20 Tensid. Nach der Zugabe der wässrigen Lösungen wurde die Absorption jeder Vertiefung der Platte bei 450 nm unter Verwendung eines PowerWave X Absorptionslesers (BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT) bestimmt. Die Daten aus beiden Experimenten wurden dann in Microsoftreg Excel exportiert und die Datenreduktion durchgeführt. Die Genauigkeit wurde unter Verwendung entweder eines gravimetrischen Verfahrens oder der Verdünnung des Farbstoffs bestimmt. Die Bestimmung mittels gravimetrischer Methode erfolgte durch Wägen der Platten, die mit 100 mul PBS vorgefüllt wurden, unter Verwendung einer analytischen Waage. Nach dem Abgeben der geeigneten Flüssigkeit auf die Platte mit dem Precision 2000 wurde die Platte schnell wieder gewogen. Die sich daraus ergebenden Gewichtsveränderungen, wenn sie durch die Anzahl der Plattenvertiefungen geteilt wurden, lieferten ein durchschnittliches pro Volumen abgegebenes Volumen zurück. Bei der Berechnung der Dosiergenauigkeit unter Verwendung der Farbstoffmethode wurde konzentrierter gelber Farbstoff mit Precision 2000 in vorgefüllte Platten pipettiert. Nach dem Mischen auf einem Orbitalschüttler für 60 Sekunden wurde die Absorption auf einem PowerWave X-Mikroplatten-Spektrophotometer (BioTek Instruments, Inc.). Die resultierenden Extinktionswerte wurden mit einer vorher vorhandenen Eichkurve verglichen und das Abgabevolumen interpoliert. Das Precision 2000 Automatisiertes Pipettiersystem führt viele der routinemäßigen Pipettieraufgaben durch, die mit der Probenvorbereitung für die Mikroarray-Spotting verbunden sind. Die Precision 2000 kann auf jeder stabilen Laborfläche, einschließlich Standard-Laborbänke, sowie mobile Wagen installiert werden. Der geringe Platzbedarf ermöglicht auch die Verwendung innerhalb eines Biosicherheitsschrankes. Die Precision 2000 kann mit Precision Powerauml Software auf einem angeschlossenen PC programmiert werden. Nachdem die Programmierung abgeschlossen ist, werden die notwendigen Dateien auf das Gerät heruntergeladen und das Precision 2000 kann eigenständig laufen. Diese Eigenschaften bieten folgende Vorteile: Das System lässt sich schnell und einfach an verschiedene Orte bewegen und einen zuverlässigen Betrieb gewährleisten. Der Endbenutzer kann das System nach Bedarf neu programmieren, ohne dass eine Neuinstallation oder Programmierung erforderlich ist. Während es zahlreiche Aufgaben gibt, die von der Precision 2000 durchgeführt werden können, sind hier einige der Aufgaben von Precision 2000 beschrieben. Beachten Sie, dass der grau hinterlegte Text die Aufgaben anzeigt, die nicht von Precision 2000 durchgeführt wurden 2: Deck Layout von Precision 2000 für Hefe Kultur PCR-Setup. Die Präzision 2000 überträgt 80 Mikroliter PCR-Mastermix, das Polymerase-Enzym, Primer und Desoxynukleotide enthält, in alle Vertiefungen einer 96-Loch PCR-Platte (orange Schattierung) aus dem Reagenztrog (gelbe Schattierung) unter Verwendung von Standardpipettenspitzen (grüne Schattierung). Unter Verwendung von Aerosolbarrierenspitzen (blaue Schattierung) überträgt das Precision 2000 20 & mgr; l Hefekultur in tiefe Wannenplatten auf die 96-Loch-PCR-Platte (orange Schattierung). PCR-Platten werden manuell auf einen MJ Research-Thermocycler übertragen, in dem ein primer-spezifischer Thermoylierungslauf durchgeführt wird. Abgeschlossene PCR-Reaktionen werden dann an einen Qiagen 3000 BioRobot zur PCR-Produktbereinigung übertragen. Nach der Primer - und Nukleotidentfernung werden PCR-Reaktionen mit einem Savant-Lyophilisator zur Trockene lyophilisiert. Nach der Lyophilisierung werden die Proben in 20-25 Mikroliter destilliertem Wasser unter Verwendung des Precision 2000 resuspendiert. Für eine kompaktere Lagerung werden Proben von vier 96-Well-Platten auf eine 384-Well-Mikroplatte übertragen und bei ndash20ordmC bis ndash80ordmC gelagert, bis sie benötigt werden. Unmittelbar vor dem Auftupfen werden die Proben aufgetaut und ein gleiches Volumen von 2X-Spotting-Puffer (mit Salzen und DMSO) unter Verwendung des Precision 2000 zugegeben. Die Proben werden dann unter Verwendung eines BioRobotics-Microarray-Spotting-Roboters entdeckt. PCR-Check-Gel Probenvorbereitung Abbildung 3: Precision 2000 Deck Layout für die Gelprobenvorbereitung. Unter Verwendung von Aerosolspitzen (blaue Schattierung) transportiert die Precision 2000 4 ml Probe aus den Vertiefungen der Qiagen-Sammelplatte zu den entsprechenden Vertiefungen einer runden Bodenplatte. Unter Verwendung normaler Spitzen (grüne Schattierung) werden 5 ml Gelbeladungspuffer zu den Proben in der runden Bodenplatte gegeben und mit dem Precision 2000 gemischt. Abbildung 4: Schließen Sie das Bild des Pipettenarms mit den Spitzen. Die Proben werden aus einer 96-Vertiefung in eine 384-Well-Mikroplatte transferiert. Ergebnisse von Precision 2000-Pipettierung mit niedrigem Volumen Wie in Fig. 5 gezeigt, wurden, wenn wßrige Lösungen in trockene Platten verteilt wurden, große Well-to-Well-Unterschiede bei sehr kleinen Volumina (weniger als 3 ml) beobachtet. Der Variationskoeffizient (CV) für eine Platte mit einer 1-mul-Abgabe wurde so groß wie 60 gefunden. Jedoch verringern sich die Well-to-Well-Unterschiede schnell mit zunehmendem Abgabevolumen. Abgabevolumen, die so klein wie 3 mul sind, haben einen CV-Wert von weniger als 4. Wenn kleine Flüssigkeitsvolumina in 384-Well-Platten abgegeben werden, wird ein ähnliches Muster der Well-to-Well-Variation beobachtet (Abbildung 6). Bei der Abgabe in trockene 384-Lochplatten werden sehr große Unterschiede zwischen den Vertiefungen bei 1-2 & mgr; m beobachtet. Allerdings zeigen Dosiervolumen größer als 3 mul hervorragende Ergebnisse. Wenn kleine wässrige Volumina in teilweise gefüllte Plattenvertiefungen verteilt werden, wird eine deutliche Verbesserung der Präzision beobachtet (Abbildung 7.) Volumina kleiner 1 Mul können mit einem Abweichungskoeffizienten kleiner als 4 ausgegeben werden Gut oder grßer ist, der CV routinemßig weniger als 2 ist. Das Muster mit erhöhter Präzision mit Abgabevolumina von 3 & mgr; m oder grßer ist in der Natur ähnlich, wie es bei der Abgabe in trockene Bohrlöcher beobachtet wird. Jedoch wird der Grad der Verbesserung als Ergebnisse der stark verbesserten Ergebnisse bei 1-2 & mgr; m Abgabevolumen (2-3,5 gegenüber 30-60 CVs) verringert. Wie in Abbildung 8 gezeigt, ermöglicht die Precision 2000rsquos Rapid Dispense Mode Option eine präzise Abgabe von Flüssigkeiten. Unter Verwendung einer 96- oder einer 384-Loch-Platte können Volumina, die so klein wie 10 & mgr; mul sind, aus dem Massenreagens-Abgabeverteiler abgegeben werden. Beim Ausgeben von 10 ml in eine Plattenvertiefung scheint es, dass die 384-Vertiefungsplatte eine bessere Präzision bietet. Jedoch scheint es bei Volumina von 20 & mgr; l oder grßer, zwischen den verschiedenen Plattenmatrizen wenig Unterschiede (Fig. 8) zu geben. Abbildung 5: Dosieren der Präzision in trockene Platten mit 96 Vertiefungen unter Verwendung der Precision 2000-Pipette bei verschiedenen Dosiervolumina. Das angegebene Volumen des TRIS-Puffers, der eine blaue Lebensmittelfärbung enthielt, wurde in alle Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen unter Verwendung der Pipette abgegeben. Nach dem Abgeben des gefärbten Farbstoffs wurden 100 Mikroliter TRIS-Puffer in jede Vertiefung unter Verwendung des Abgabeverteilers mit einer Geschwindigkeitseinstellung von 5 abgegeben. Die Extinktion bei 595 nm für jede Vertiefung jeder Platte wurde unter Verwendung eines Mikroplatten-Absorptionslesers bestimmt. Beachten Sie, dass jede Datenleiste die CV einer ganzen Platte darstellt. Abbildung 6: Präzision in trockene 384-Well-Platten mit der Precision 2000-Pipette bei verschiedenen Dosiervolumina verteilen. Das angegebene Volumen von TRIS-Puffer, der eine blaue Lebensmittelfärbung enthielt, wurde in alle Vertiefungen einer 384-Napf-Platte unter Verwendung der Pipette abgegeben. Nach dem Abgeben des gefärbten Farbstoffs wurden 50 Mikroliter TRIS-Puffer in jede Vertiefung unter Verwendung des Abgabeverteilers mit einer Geschwindigkeitseinstellung von 5 abgegeben. Die Absorption bei 595 nm für jede Vertiefung jeder Platte wurde unter Verwendung eines Mikroplatten-Absorptionslesers bestimmt. Beachten Sie, dass jede Datenleiste die CV einer ganzen Platte darstellt. Abbildung 7: Dosiergenauigkeit in partiell gefüllte 96-Well-Platten mit der Precision 2000-Pipette bei verschiedenen Dosiervolumina. In jede Vertiefung einer Platte wurden 100 Mikroliter QC-Prüflösung 3 unter Verwendung der Pipette als Verdünnungsmittel abgegeben. Als nächstes wurde das angegebene Volumen des gelben Farbstoffs in alle Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen unter Verwendung der Pipette abgegeben. Die Absorption bei 450 nm für jede Vertiefung jeder Platte wurde unter Verwendung eines PowerWaveX-Mikroplatten-Spektrophotometers (BioTek Instruments, Winooski, VT) bestimmt. Beachten Sie, dass jede Datenleiste die CV einer ganzen Platte darstellt. Abbildung 8: Dosiergenauigkeit in trockene 96- oder 384-Well-Platten mit dem Precision 2000-Verteiler bei verschiedenen Dosiervolumina. Das angegebene Volumen des TRIS-Puffers, der eine blaue Lebensmittelfärbung enthielt, wurde an alle Vertiefungen entweder einer 96- oder einer 384-Vertiefungsplatte unter Verwendung des Verteilers abgegeben. Nach dem Abgeben des gefärbten Farbstoffs wurde die Pufferflasche nur in den TRIS-Puffer gewechselt, und entweder 100 ml oder 50 ml TRIS-Puffer wurden in jede Vertiefung der 96- oder 384-Well-Platten jeweils unter Verwendung des Verteilers mit einer Geschwindigkeitseinstellung von 5 gegeben. Die Extinktion bei 595 nm für jede Vertiefung jeder Platte wurde unter Verwendung eines Mikroplatten-Absorptionslesers bestimmt. Beachten Sie, dass jede Datenleiste die CV einer ganzen Platte darstellt. Diskussion Diese Daten zeigen, dass die Präzision 2000 verwendet werden kann, um die kleinen wässrigen Volumina, die für die Mikroarray-Probenpräparation notwendig sind, präzise und genau abzugeben. Die Verwendung des Pipettenarms ermöglicht unbegrenzte Flexibilität in Bezug auf Flüssigkeitstransfer. Der in der Precision 2000rsquos Rapid Dispense Mode Option verwendete Verteiler ist auch für kleinvolumige Dosierungen sehr nützlich. Dieses Massenreagens-Abgabeverteiler hat den Vorteil, daß es sehr schnell ist, und ist bei der Abgabe bis zu nur 10 Mikroliter pro Vertiefung sehr nützlich. Mehrere Faktoren beeinflussen die Fähigkeit, kleine Volumina mit dem Precision 2000 zu verteilen. Die Verdrängungsspritzen hängen von der Verschiebung von Luft ab, um das Fluid aus dem Faß der Spitze zu schieben. Unglücklicherweise sind gasförmige Materialien im Gegensatz zu Flüssigkeiten anfällig für eine Kompression, was nahelegt, daß die Genauigkeit bei großen Volumina (z. B. 100 & mgr; l) auftritt, wo der Großteil der Säule flüssig ist. Dies schließt oft die Fähigkeit aus, bei deutlich kleineren Volumina genau zu sein. Da Luft auch aufgrund von Temperaturänderungen anfällig für Expansion und Kontraktion ist, werden Proben und Reagenzien, die auf Umgebungstemperatur äquilibriert sind, zu einer genaueren und präzisen Abgabe führen. Für die genauesten und präzisesten Dosierungen ist es ratsam, eine erste Vorabnahme eines kleinen Volumens vorzunehmen. Dies wird eine gewisse Kompensation für die Kompression des Luftgases bereitstellen und eine feuchte Umgebung innerhalb der Pipettenspitze schaffen. Die Abgabe in eine Flüssigkeit ist im Allgemeinen genauer und genauer als die Ausgabe in eine leere Wanne. Dieses Phänomen ist höchstwahrscheinlich aufgrund der kleinen Menge der Fluide, die auf die Außenseite der Pipettenspitze aufsaugen und nicht in die Vertiefung abgegeben werden. Beim Abgeben in eine vorher vorhandene Flüssigkeit ist es wahrscheinlich, dass sich Fluid aufgrund der Oberflächenspannung in die Flüssigkeit dispergiert als auf die Spitze. Das Präzisions-2000-Mikroplatten-Pipettiersystem ist ein präzises und präzises Flüssigkeits-Handhabungssystem, das die meisten Routine-Pipettier-, Abgabe - und Verdünnungsanwendungen automatisieren kann. Ideal für ein flexibles und vielseitiges automatisiertes System mit geringem Platzbedarf, es hat sich als sehr platzierfähig erwiesen (1 Mikrolinie), um die heutigen niedrigen Assayvolumina unterzubringen. Die Flexibilität und Beweglichkeit dieses Systems ermöglicht es, viele der manuellen Pipettieraufgaben, die für die Mikroarray-Spotting-Technik erforderlich sind, zu automatisieren. Referenzen Held, P. und Cohen, D. (2000) Mit BioTekrsquos Precision 2000 zur Verteilung kleiner Volumina. Anwendungshinweise, BioTek Instruments Inc. Highland Park, Box 998 Winooski, VT 05404, biotek TradeMarks und Copyrights Precision 2000, Precision Power, PowerWave sind alle Marken der BioTek Instruments, Winooski, VT. Microsoftreg Excel und ActiveXreg sind urheberrechtlich geschützt durch Microsoft Corporation, Redman, WA. How zu berechnen Relative Genauigkeit Thermometer Bild von Dusan Radivojevic aus Fotolia In der Wissenschaft der Messung Dinge, bezieht sich Genauigkeit auf den Unterschied zwischen einer Messung von einem Messgerät und eine tatsächliche genommen Wert. Zum Beispiel ist ein Thermometer-Messwert von 60 Grad Fahrenheit, wenn die tatsächliche Temperatur 62 Grad Fahrenheit ist nicht absolut genau, obwohl es genauer als ein Thermometer-Messwert von 58 Grad Fahrenheit während der gleichen Zeit ist. Die relative Genauigkeit einer Messung kann als Prozentsatz ausgedrückt werden, den Sie sagen können, dass ein Thermometer 98 Prozent genau ist, oder dass es innerhalb von 2 Prozent genau ist. Diese Prozentsätze lassen sich leicht berechnen. Ermitteln Sie das Gerät, für das Sie die relative Messgenauigkeit berechnen möchten. Zum Beispiel möchten Sie vielleicht wissen, wie genau Ihre Thermometer Temperatur Messwerte sind. Verwenden Sie das Werkzeug, um etwas zu messen, für das Sie den genauen Wert kennen. Zum Beispiel, eine Tasse Eiswasser ist 32 Grad Fahrenheit, so dass dies ein geeignetes Maß zu verwenden. Ihr Thermometer könnte die Temperatur des Wassers bei 31 Grad Fahrenheit messen. Subtrahieren Sie die Differenz zwischen dem Istwert und der Messung vom Istwert und dividieren Sie das Ergebnis durch den Istwert, um die Genauigkeit der Messung zu erhalten. Für unser Thermometer Beispiel: Genauigkeit (Istwert - (Istwert - Messung)) Istwert (32- (32 - 31)) 32 0,968 Multiplizieren Sie das Ergebnis mit 100%, um die Genauigkeit in einen Prozentsatz umzuwandeln. Für unser Thermometer Beispiel: Relative Genauigkeit Genauigkeit x 100 Prozent 0,968 x 100 Prozent 96,8 Prozent Die Thermometer lesen des Eiswassers waren 96,8 Prozent genau.
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